| Strona główna | Mikotoksyny |  

ZASTOSOWANIE KOLUMN POWINOWACTWA IMMUNOLOGICZNEGO

W ANALIZIE MIKOTOKSYN

SPECIAL REPORT SCOTT&TRUCKSESS: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 80, No. 5, 1997 941-949.

Peter M.Scott¹; Mary W. Trucksess²

¹ Health Canada, Health Protection Branch, Food Research Division, Adress Locator 2203, Sir Frederic G. Banting Research Centre, Ottawa, ON KIA 0L2, Kanada

² U.S. Food and Drug Administration, Centre for Food Safety and Applied Nutrion, 200 St. SW, Washington, DC 20204

Kolumny powinowactwa immunologicznego (immunoaffinity column, IAC) są często stosowane do oczyszczania i izolacji ekstrahowanych z żywności i płynów ustrojowych mikotoksyn, przede wszystkim aflatoksyn, ochratoksyny A i fumonizyn. Przygotowanie kolumn obejmuje wiązanie na specjalnie aktywowanym, stałym podłożu przeciwciał, skierowanych specyficznie przeciwko danej mikotoksynie, i następnie pakowanie wodnej zawiesiny tak przygotowanego podłoża do kolumny. Zawarte w ekstrakcie lub płynie mikotoksyny wiążą się z przeciwciałem, zanieczyszczenia są usuwane przez płukanie wodą lub roztworami wodnymi, po czym mikotoksyny są uwalniane (ulegają desorpcji) rozpuszczalnikiem mieszającym się z wodą, np. metanolem. Po rozdziale na kolumnach powinowactwa immunologicznego (IAC) można dokonać oznaczenia ilościowego w systemie automatycznym lub nieautomatycznym metodą chromatografii cieczowej (LC) albo metodą fluorymetrii. Kolumny powinowactwa immunologicznego stosowano w laboratoriach, w których przygotowano przeciwciała; są również dostępne w handlu kolumny dla aflatoksyn, ochratoksyny A, fumonizyn, zearalenonu i deoksyniwalenolu. Z komercyjnie dostępnych na rynku IAC, do oczyszczania przed oznaczaniem aflatoksyn metodą fluorymetrii roztworu używane są kolumny Aflatest P; metoda ta, po ocenie w międzynarodowych badaniach międzylaboratoryjnych, została przyjęta jako Urzędowa Metoda AOAC International do oznaczania aflatoksyn w kukurydzy, orzechach ziemnych i maśle orzechowym. Następnie, Instytut Badawczy AOAC (AOAC Research Institute) zalegalizował używanie kolumn Aflatest P, jako części zestawu do oznaczania fluorymetrycznego, do pomiarów sumy zawartości aflatoksyn w 10 zbożach i produktach zbożowych. Przy użyciu kolumn IAC można zagęszczać analit, zawarty w dużych ilościach próbki, co w niektórych przypadkach (na przykład dla aflatoksyny M₁ i ochratoksyny A w żywności płynnej) pozwala na osiągnięcie granic wykrywalności na tak niskim poziomie jak części na trylion (part per trillion, ppt). Badane są możliwości regeneracji i kilkukrotnego używania kolumn IAC dla aflatoksyn, ochratoksyny A, fumonizyn i zearalenonu.

Mikotoksyny są toksycznymi metabolitami wtórnymi produkowanym przez strzępki grzybów porastające artykuły rolne na polu lub podczas przechowywania (1). W ciągu ostatnich 30 lat wiele uwagi poświęcono poszukiwaniu metod detekcji i oznaczania mikotoksyn w żywności, paszach i płynach ustrojowych. Ciągły rozwój, jaki ma miejsce w tej dziedzinie, najlepiej widać w rocznych sprawozdaniach AOAC INTERNATIONAL General Referee on Mycotoxin (2). Metody dla mikotoksyn są potrzebne aby badać zgodność z tolerancją i wytycznymi do monitorowania i oznaczeń; do badań w takich dziedzinach jak epidemiologia, mikologia, metabolizm, farmakokinetyka, obróbka żywności i dekontaminacja.

W procesie analizy mikotoksyn konieczne jest oczyszczenie ekstraktów próbek, zwłaszcza w przypadkach kiedy do ostatecznego oznaczania używa się metod chromatograficznych. Nową, ważną techniką stosowaną do oczyszczenia mikotoksyn jest kolumna powinowactwa immunologicznego ze związanym przeciwciałem. Wyprodukowano przeciwciała skierowane wybiórczo przeciwko wielu mikotoksynom. Metody produkcji i charakterystyka tych przeciwciał zostały przedstawione w pracy Chu (4); autor dyskutuje metody tworzenia immunogenów, od mikotoksyn do białek, izolację przeciwciał poliklonalnych z surowic immunizowanych zwierząt, produkcję przeciwciał monoklonalnych w hodowlach komórkowych lub płynie otrzewnowym myszy.

Przeciwciała skierowane przeciwko mikotoksynom są oczyszczane przez wytrącanie siarczanem amonu, metodą chromatografii jonowymiennej, przez filtrację na żelu lub na drodze chromatografii powinowactwa. Przeciwciało jest unieruchomione na obojętnym, stałym podłożu, takim jak np. żel agarozowy (Sefaroza). Dostępne są różne podłoża, które zwykle aktywuje się odpowiednimi czynnikami aktywującymi, na przykład bromkiem cyjanu (cyanogen bromide), aldehydem glutarowym, po czym wiąże kowalencyjnie z przeciwciałem (3). Następnie stałe podłoże, zawieszone w buforze fosforanowym, jest pakowane do plastikowych kolumn (plastic cartridge).

Łatwiej jest produkować przeciwciała poliklonalne niż monoklonalne. Chętniej używane są jednak te ostatnie, ponieważ charakteryzują się jednakowym powinowactwem i specyficznością oraz umożliwiają produkcję komercyjnych kolumn powinowactwa immunologicznego. Ważnymi właściwościami przeciwciał, wykorzystywanych do produkcji kolumn, są: specyficzność, powinowactwo, stabilność w warunkach stosowanych w czasie płukania oraz odwracalność. Niezwykle ważna jest właśnie odwracalność łączenia się kompleksu mikotoksyna-antygen, gdyż mikotoksyna musi zostać uwolniona (3).

Kolumny powinowactwa są stosowane do oczyszczania i zatężania mikotoksyn. Ekstrakt z próbki lub ciekła matryca, np. piwo czy mleko, są podawane na kolumnę; podczas przechodzenia przez podłoże dochodzi do selektywnego wiązania mikotoksyn. Przypływ cieczy przez kolumnę wymusza się strzykawką. W niektórych przypadkach wystarczający jest przepływ grawitacyjny. Aby usunąć zanieczyszczenia kolumnę przemywa się wodą lub buforem, i następnie analit wymywa małą objętością rozpuszczalnika np. metanolem, acetonitrylem lub wodnym roztworem dimetylosulfotlenku (DMSO). Detekcji i oznaczenia ilościowego analitu dokonuje się po wymyciu z kolumny, metodą fluorymetryczną lub obserwując fluorescencencję Florosilu albo metodą chromatografii cieczowej (LC), w razie potrzeby otrzymując pochodną przed lub po rozdziale na kolumnie (3).

Przedmiotem niniejszej pracy są komercyjnie dostępne kolumny powinowactwa immunologicznego, służące do oczyszczania następujących mikotoksyn: aflatoksyny B₁, B₂, G₁ i G₂, aflatoksyny M₁, ochratoksyny A, fumonizyn B₁ i B₂, zearalenonu i deoksyniwalenolu (5). Kolumny zawierające przeciwciała monoklonalne przeciwko aflatoksynie B₁ zatrzymują również składniki (compounds) i adukty (adducts) związane z aflatoksyną B₁. Tego typu kolumny powinowactwa znajdują zastosowanie w analizie tkanek ludzkich i płynów ustrojowych (6). Wyprodukowano przeciwciała rozpoznające inne mikotoksyny – np. cytryninę, kwas cyklopiazonowy, fuzarochromanon, kwas kojowy, patulinę, rubratoksynę B, kwas sekalowy, sterigmocystynę i niektóre trichoteceny poza deoksyniwalenolem (4). Nie powstały jeszcze kolumny powinowactwa z zastosowaniem tych przeciwciał.
 
 
 
 

Aflatoksyny B₁, B₂, G₁ i G₂

Kolumny

W pracy Groopmana i wsp. (7) opisano wyprodukowaniu monoklonalnego przeciwciała z klasy immunoglobulin M (IgM) o wysokim powinowactwie do aflatoksyn B₁ i B₂, aflatoksyny M₁ i najważniejszych aduktów aflatoksyny-DNA ([2,3-dihydro-2-(N⁷-guanylo)-3-hydroxyaflatoksyna B₁, AF- N⁷Gua i [2,3-dihydro-2-(N⁵-formylo-2c ,5c ,6c -triamino-4c -okso- N⁵-pyrimidylo)-3- hydroxyaflatoksyna B₁, AF-FAPyr). Do izolacji aflatoksyn z płynów ustrojowych (mocz, surowica i mleko) wstępnie oczyszczeniu na kolumnie C₁₈ SPE stosuje się kolumnę powinowactwa immunologicznego wypełnioną przeciwciałem monoklonalnym związanym kowalencyjnie z Sefarozą 4B aktywowaną bromkiem cyjanu.

Kolumny powinowactwa immunologicznego zawierające przeciwciała monoklonalne są do tej pory dostępne komercyjnie w Stanach Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii. W Europie, do oczyszczania ekstraktów izolowanych z różnego rodzaju pasz i artykułów żywnościowych używano kolumn zwanych Aflaprep produkowanych przez Vicam (Watertown, Minnesota) oraz kolumn sprzedawanych przez firmę Rhone-Poulenc Diagnostic (Glasgow, Szkocja) (8-13). Kolumny Aflaprep były także wykorzystywane do wykrywania aflatoksyn B₁, B₂, G₁, G₂, M₂, P₂ i Q₁ metodą chromatografii cieczowej w moczu robotników fabryki narażonych na kurz (14).

Firma Vicam sprzedaje obecnie 2 rodzaje kolumn IAC: Aflatest-10, której można używać tylko do aflatoksyn B₁ i B₂ oraz Aflatest P, które można stosować do aflatoksyn B₁ i B₂, G₁ i G₂ oraz M₂. Przy pomocy kolumn Aflatest-10 badano występowanie aflatoksyn w ziarnach bawełny, kukurydzy, orzeszkach ziemnych, figach i artykułach żywnościowych (15-17), chociaż uzyskiwano niewielkie odzyski aflatoksyn B₂ G₂ i z różnych rodzajów żywności i pasz.

Kolumny Aflatest P znajdują szerokie zastosowanie w badaniach kukurydzy, orzechów ziemnych, innych artykułach żywnościowych i pasz oraz w analizie moczu (Vicam, informacje niepublikowane 1996; 18-22). Granice wykrywalności dla metody wykorzystującej kolumny powinowactwa wynoszą 0,12-0,25 ng aflatoksyny/g w paszy dla gryzoni (20) i 0,05 ng/ml moczu (21). W 1994 roku Instytut Badawczy AOAC zatwierdził zestaw do oznaczania Aflatest P, który zawiera fluorometr do pomiarów sumy zawartości aflatoksyn w zbożu (23).

Niektórzy autorzy podają nazwę używanych przez siebie kolumn – Aflatest, jest to starsza nazwa kolumn używana przez Vicam i Rhone-Poulenc (May & Baker Diagnostic Ltd.). Kussak i wsp. (27) wymieniają inny produk firmowy zwanym Aflascan.

Inne popularne kolumny powinowactwa immunologicznego to kolumny Easi-Extract, wyprodukowane przez firmę Biocode Ltd (York, Wielka Brytania), wcześniej znaną pod nazwą Microtest Research. Początkowo kolumny te były sprzedawane jako część zestawu do oznaczania sumy zawartości aflatoksyn, w którym obejmował dodatkowo minikolumny zawierające Florosil do detekcji (28, 29). Rhone-Poulenc Diagnostic Ltd. nie jest właścicielem Easi-Extract. Kolumny Easi-Extract stosowano do oznaczania aflatoksyn w orzechach i produktach wytwarzanych z orzechów, piwie, zbożach, paszach, olejach jadalnych, suszonych owocach, przyprawach i innych produktach żywnościowych (8, 11, 12, 22, 26, 28-41). Granice wykrywalności aflatoksyn są tak małe jak 0,06 ng/g w przyprawach (29).

Wiele kolumn powinowactwa immunologicznego przygotowano w laboratoriach badawczych (6, 7, 42-44). Podłoża stosowane w tych kolumnach obejmują aktywowaną Sefarozę 4B, preaktywowany Utrożel AcA 22 (42) i aktywowanej epoksydem kopolimer hydroksyetylometaakrylan-dimetyloakrylan (Protein Pak; 43). Jedno z podłoży aktywowanych epoksydem, zwane HEMA-Afc-Bio 1000 ma wysokie powinowactwo do aflatoksyn bez łączenia z przeciwciałem (43).

W jednej z nielicznych prac, w której porównywano różne kolumny powinowactwa immunologicznego stwierdzono, że Alfaprep i Easi-Extract są równie odpowiednie do oczyszczania rozcieńczonych ekstraktów z pistacji, zawierających <15% metanolu (8). W próbach miedzylaboratoryjnych (12) dotyczących oznaczania aflatoksyn w maśle orzechowym, w których w jednym z 21 laboratoriów używano Alfaprep, a w pozostałych Easi-Extract stwierdzono, że przeciwciała w obu kolumnach mają jednakowe powinowactwo do aflatoksyny G₁, głównej aflatoksyny obecnej w próbkach. W półilościowych oznaczeniach sumy zawartości aflatoksyn metodą Florisilu lub na minikolumnach, kolumny Aflatest-10 i zestaw testowy “Oxoid total aflatoxin test” dają zadowalające wyniki przy badaniu kukurydzy, ale niezadowalające dla mieszanek paszowych (16).

Wpływ rozpuszczalnika używanego do ekstrakcji

Najczęściej używanym rozpuszczalnikiem do ekstrakcji aflatoksyn z pasz i żywności jest mieszanina metanolu z wodą w stosunku objętościowym od 60+40 do 80+20 (v/v). W niektórych przypadkach dodaje się chlorku sodu. Ze względu na dużą zawartość metanolu w ekstrakcie trzeba rozcieńczyć go wodą lub buforem PBS, tak aby zmniejszyć stężenie metanolu do 16-30% lub nawet 5% (12, 13, 15, 18-20, 25, 29, 31, 37, 43-45).

Kolumny IAC mogą wytrzymać tylko bardzo niskie stężenia acetonitrylu. Rozpuszczalnik do ekstrakcji, który zawiera mieszaninę acetonitrylu i wody (w stosunku objętościowym 60+40 do 75+25) trzeba przed podaniem ekstraktu na kolumnę bardziej rozcieńczyć buforem PBS lub wodą, tak aby stężenie acetonitrylu było mniejsze niż 7% (11, 30, 32-34, 36, 41).

Podobnie, ekstrakty zawierające mieszaninę acetonu z wodą (w stosunku objętościowym od 80+20 do 85+15) należy rozcieńczyć do końcowego stężenia acetonu mniejszego niż 8,5% (9, 27, 45). Wpływ końcowego stężenia acetonu na odzysk aflatoksyn z kolumny IAC badali Egana i Cavendish (45). Stwierdzili, ze nawet 1% aceton powoduje utratę aflatoksyny G₂, natomiast gdy stężenie acetonu wynosi 20% mały jest odzysk aflatoksyny B₂. Ostatecznie autorzy stwierdzili, że przy analizie orzechów ziemnych, masła orzechowego, jąder nasion moreli, pasty z fig, kopry, papryki i kukurydzy najlepsze warunki pracy kolumny zapewnia roztwór o końcowe stężenie acetonu 2% (45).

Porównanie metody oznaczania z zastosowaniem kolumn powinowactwa immunologicznego i innych metod

Metody ilościowego oznaczania aflatoksyn i metody przesiewowe, w których używa się do oczyszczania kolumn powinowactwa immunologicznego porównywano z metodami, w których wykorzystuje się inne sposoby oczyszczania, lub nie wymagającymi tego etapu, jak np. test immunoenzymatyczny (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Bradburn i wsp. (11) porównali wydajność dwóch kolumn powinowactwa immunologicznego i kolumny z fenolową fazą stałą (phenol-bounded phase cartridge) do oczyszczania acetonowowodnych ekstraktów z kukurydzy i sorga. Do oznaczenia ilościowego aflatoksyny B₁ zastosowali dwukierunkową, wysokosprawną chromatografię cienkowarstwową (HTPLC). W przypadku kukurydzy dla obu metod uzyskano zbliżone wartości dokładności i precyzji, natomiast w przypadku sorga oczyszczanie na kolumnie z fenolową fazą stałą pozwalało osiągnąć lepszą dokładność i precyzję.

Podobne wyniki uzyskuje się przy użyciu kolumny powinowactwa immunologicznego i procedury ekstrakcji do silikonowej fazy stałej (silica-solid phase extraction, SPE) w badaniach mąki z orzechów ziemnych dają zazwyczaj podobne wyniki dla aflatoksyn B₁ i B₂, które tworzą jedyny pik w chromatogramie (39).

Stosowanie kolumn Aflatest do badań hodowli kukurydzy (24) ma niezaprzeczalne zalety, takie jak oszczędność czasu, łatwość użycia, mniejsze zużycie rozpuszczalnika i fakt, że nie ma znaczących różnic w oznaczaniu ilościowym sumy zawartości aflatoksyn w porównaniu z rozdziałem opartym o ekstrakcję ciecz - ciecz (solvent partition-based-method) (46).

Przeprowadzono porównanie metod oznaczania z kolumnami powinowactwa immunologicznego z 2 metodami zalecanymi przez AOAC – metodą CB (TLC; 47) i metodą chromatografii cieczowej Tartera (LC; 48). W jednym oznaczeniu odzyski aflatoksyny B₁ z orzechów po zastosowaniu kolumn powinowactwa immunologicznego (Easi-Extract) (32) były znacznie większe, zaś w innym (37) z reguły większe z różnych artykułów żywnościowych i pasz. W trzecim oznaczeniu stwierdzono istnienie bardzo dobrej zgodności wyników dla aflatoksyn B₁ i B₂ uzyskanych zautomatyzowaną metodą IAC i metodą CB w kukurydzy i innych środkach spożywczych (18).

Porównano metodę oznaczania aflatoksyn w zbożu, owocach i orzechach, obejmującą użycie kolumn Easi-Extract przed chromatografią cieczową lub TCL z ilościową metodą immunoenzymatyczną (ELISA) (31). W próbkach fortyfikowanych po zastosowaniu metody ELISA odzyski aflatoksyny B₁ były większe (98% wobec 72%), a w próbkach zanieczyszczonych naturalnie odzyski sumy aflatoksyn dla obu metod były zbliżone. Granica wykrywalności dla obu metod wynosił 0,5 ng aflatoksyny B₁/g. Dodatkowo, w badaniach polowych na farmach orzechów ziemnych w których oznaczano sumę zawartości aflatoksyn (w różnych laboratoriach stosowano różne procedury oznaczania) uzyskano podobne wyniki podczas szybkiego oznaczenia z wykorzystaniem kolumn Aflatest i fluorometru oraz ilościowej metody ELISA; poziomy aflatoksyn uzyskane oboma metodami są niższe niż te, które uzyskuje się metodą chromatografii cieczowej (26).

Międzylaboratoryjne badania porównawcze

Metodę oznaczania aflatoksyn w kukurydzy, orzechach ziemnych i maśle orzechowym z wykorzystaniem kolumn Aflatest P połączonych z fluorymetrią w roztworze z bromem lub chromatografią cieczową z otrzymywaniem pochodnych z jodem po rozdziale na kolumnie, poddano badaniom międzylaboratoryjnym w 20 laboratoriach (19). Odzyski sumy aflatoksyn (10-30 ng/g) mierzone metodą fluorymetrii stanowiły 123%, a metodą chromatografii cieczowej 81-83%. Została ona uznana przez AOAC INTERNATIONAL za zalecaną metodę (49).

W badaniach międzylaboratoryjnych sprawdzano też metodę oznaczania aflatoksyn w maśle orzechowym z wykorzystaniem kolumn powinowactwa immunologicznego Biocode. W oznaczeniach wstępnych, podczas których badacze mogli wybierać technikę doświadczalną do oznaczania metodą chromatografii cieczowej, średni odzysk aflatoksyny B₁ wynosił 72% (33). W międzynarodowych badaniach międzylaboratoryjnych, w których określono, że należy zastosować metodę z otrzymywaniem pochodnych z jodem po rozdziale na kolumnie odzyski aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂ osiągały 67% (60% dla B₁). Takie odzyski są zbyt małe, aby można było rozważać oficjalne zalecanie tej metody.

W innych badaniach międzylaboratoryjnych, dotyczących oceny przydatności kolumn Aflaprep do chromatografii cieczowej podczas oznaczania aflatoksyn w maśle orzechowym nie używano próbek fortyfikowanych, a co za tym idzie, nie oznaczono odzysków.

Kolumny powinowactwa immunologicznego Aflaprep charakteryzowano w Skandynawii w międzylaboratoryjnych badaniach dotyczących oznaczania aflatoksyn metodą chromatografii cieczowej w orzechach ziemnych, figach, kukurydzy, glutenie, przetworach sojowych i koprze (15). Odzyski aflatoksyn B₁ i G₂ wynosiły 49-72%, ale odzyski aflatoksyny B₂ (19-47%) i G₂ (9-22%) były zbyt małe.

W szczegółowej ocenie metod ilościowego oznaczania aflatoksyn w nasionach bawełny i ziarnie kukurydzianym w różnych miejscach na polu lub laboratoriach, obejmujących Aflatest-10, Oxoid (Easi-Extract) i zestaw Aflatest P, stwierdzono, że sprawdzają się one tak samo dobrze jak metoda immunoenzymatyczna i minikolumny (17, 22). Co prawda w badaniach kukurydzy wzięło udział tylko 6 laboratoriów, ale należy je uważać za badania międzylaboratoryjne (22).

Automatyzacja

Opracowano zautomatyzowaną metodę oznaczania aflatoksyn z użyciem kolumny immunologicznej. Stacja robocza Minilab 1A (Waters) przeprowadza automatyczną filtrację kurzu (airborn dust) z powietrza i oczyszczanie na kolumnie powinowactwa immunologicznego (27). Do tego mogą być dołączone dodatkowe, zautomatyzowane etapy. Po ekstrakcji aflatoksyn ze środków spożywczych wodnym roztworem metanolu, rozcieńczeniu, wymieszaniu, i oczyszczeniu na kolumnach powinowactwa automatyczna stacja robocza może przeprowadzać (opcjonalnie przeprowadza) chromatografię cieczową on-line (Zymark Benchmate; 8). W systemie zautomatyzowanym odzyski i powtarzalność były nieznacznie lepsze niż w systemie oczyszczania ręcznego. Granice wykrywalności aflatoksyn B₁ i G₁ w systemie tym wynosiły 0,1 ng/g, a dla aflatoksyn B₂ i G₂ 0,03 ng/g.

Porównano również system BenchMate z innym, dostępnym komercyjnie zautomatyzowanym układem do przygotowywania próbek, zwanym ASPEC (30). Ze względu na większą objętość probówek do przeprowadzania prób, ASPEC pozwala na użycie mieszanin ekstrakcyjnych złożonych z acetonitrylu i wody. Jak zauważono wyżej, takie ekstrakty wymagają silniejszego rozcieńczania wodą niż ekstrakty metanolowe.

Do oznaczania aflatoksyn w kukurydzy i orzechach ziemnych opracowano zautomatyzowany system wielokrotnego użytku kolumna powinowactwa immunologicznego – chromatografia cieczowa (IAC-LC), który zawiera automatyczny zawór przełączający (43). Całkowicie zautomatyzowane oznaczanie aflatoksyn w żywności - obejmujące ważenie, obróbkę, odparowanie oraz zamykanie i otwieranie pojemników – przeprowadza się w układzie zrobotyzowanym (robot Zymate I z akcesoriami dodatkowymi; 18). Pod warunkiem przeprowadzania regularnych przeglądach i konserwacji system ten jest niezawodny przy szybkich badaniach przesiewowych pod kątem aflatoksyn (15-30 minut na próbkę), chociaż odzyski aflatoksyny G₂ są bardzo niskie.

Aflatoksyna M₁

Pierwsze przeciwciało przeciwko aflatoksynie M₁ (poliklonalne) wyprodukowali Harder i Chu (50). Kolumnę wielokrotnego użytku do izolacji aflatoksyny B₁, M₁ i AF-N⁷-Gua z płynów ustrojowych opisano w pracy Groopmana i wsp. (97). Pierwszą komercyjnie dostępną kolumną powinowactwa immunologicznego do analizy aflatoksyny M₁ była kolumna Easi-Extract. Pierwotnie opracowano ją w Microtest Reaserch do oznaczania aflatoksyn B i G i stosowano do oznaczania aflatoksyny M1 w odtłuszczonym mleku, odtworzonym mleku w proszku i w żółtym serze (51, 52). Przez kolumnę można przepuścić aż 1000 ml mleka, dzięki czemu w chromatografii cieczowej można osiągnąć niezwykle niską granicę wykrywalności, rzędu 0,05 ng/l (51). Taką samą granicę wykrywalności można osiągnąć w badaniach ekstraktów izolowanych chloroformem z sera po oczyszczeniu metodą ekstrakcji ciecz - ciecz (52).

Inni badacze do izolacji aflatoksyny M₁ z produktów mlecznych wykorzystywali kolumny Easi-Extract (31, 37), ale na ta kolumnę nie można podać więcej niż 50 ml odtworzonego mleka w proszku (37). Do oznaczeń aflatoksyny M₁ w mleku i serze stosowano też kolumn Aflatest (53), Aflatest P (18, 54, 55) i Alfaprep M (54, 56-58). Ponieważ na kolumnę można nakładać bardziej dogodne objętości, granice wykrywalności w chromatografii cieczowej są w możliwym do zaakceptowania zakresie 0,01-0,05 ng/ml lub ng/g. W badaniach porównawczych przeprowadzonych na Tajwanie (54) stwierdzono, że odzyski aflatoksyny M₁ z kolumn Aflatest P i Alfaprep M są podobne (około 90%). Inne kolumny powinowactwa immunologicznego opracowano do badania aflatoksyny M₁ w mleku (59) i surowicy z krwi ludzkiej (96). W oznaczeniu immunoenzymatycznym (ELISA) zmodyfikowanym (streptawidyna - biotyna) (streptavidimn-biotin modified ELISA) granica wykrywalności rzędu 2 ng/kg mleka osiągnięto tylko przy podawaniu na kolumnę 20 ml

odtłuszczonego mleka rozcieńczonego w buforze PBS (1+1 v/v) (59). Oczyszczanie na kolumnie powinowactwa immunologicznego, połączone z fluorymetrią, jest nadzwyczajnie szybką i dokładną metodą oznaczania ilościowego aflatoksyny M₁, która daje wyniki porównywalne z uzyskiwanymi metodą chromatografii cieczowej (53).

Z ekstraktów z mleka i sera, oczyszczanych na kolumnie powinowactwa immunologicznego, uzyskiwano czystsze chromatogramy niż z tych oczyszczanych metodą SPE (37, 57) ale odzyski przy stężeniach AF 100 ng/l mleka były niższe (55). Dla mleka w proszku kolumny powinowactwa immunologicznego dawały niższe odzyski niż ELISA (31). Z drugiej strony , kolumny powinowactwa odzyskiwały w chromatografii cieczowej 35% więcej aflatoksyny M₁ niż kolumny z żelem silikonowym (61).

Przeprowadzono tylko jedno badanie międzylaboratoryjne, dotyczące przydatności kolumn powinowactwa immunologicznego przy oznaczaniu aflatoksyny M₁ (62). W badanym zakresie stężeń aflatoksyny 80-600 ng/kg mleka w proszku (to jest 8-60 ng/ l odtworzonego mleka) odtwarzalność wynosiła 11-23%. Ponieważ dla 3 badanych materiałów istniał certyfikowany materiał referencyjny, możliwe było oszacowanie dokładności. Ustalenie dokładności w wyniku badań międzylaboratoryjnych wskazuje, że uzyskane wyniki były o 35% niższe.

Opisano zautomatyzowany system do oznaczania aflatoksyny M₁ w mleku (18, 63-65). Kolumnę powinowactwa immunologicznego i kolumnę C₁₈ połączono on line z chromatografem cieczowym za pośrednictwem jednostki wyłączającej kolumnę i 3 pomp. Osiągnięto granicę wykrywalności 10-20 ng aflatoksyny M₁/l mleka (63, 64).Modyfikacja tej metody, polegająca na zastosowaniu dializy przed podaniem na kolumnę, spowodowała zmniejszenie sumy odzysku do 6%. Do oznaczania aflatoksyny M₁ w mleku można zastosować metodę zautomatyzowaną stosowaną do aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂ (18). Odzyski wynoszą średnio 78% w zakresie 120-150 ng/l.
 
 

Inne aflatoksyny oraz adukty

Do izolacji produktów hydrolizy i aduktów aflatoksyny B₁ z płynów ustrojowych i tkanek, przed oznaczaniem ich metodą chromatografii cieczowej, wykorzystano kolumny powinowactwa immunologicznego zawierające przeciwciała monoklonalne, rozpoznające produkty hydrolizy aflatoksyny B₁-DNA (AF-N⁷-Gua i AF-FAPyr), aflatoksynę P₁ (metabolit aflatoksyny B₁), aflatoksyno-dihydrodiol i AF-lizynę (zhydrolizowane produkty połączenia aflatoksyny B₁ z lizyną albuminy) (7, 14, 66-72). Oznaczano poziom AF-N⁷-Gua, aflatoksyny P_{1 i} aflatoksyny M₁ w moczu szczurów karmionych aflatoksyną B₁. W moczu ludzi narażonych na pobieranie aflatoksyny ze środowiska znaleziono aflatoksyny G₁, P₁, Q₁ i M₁ oraz AF-N⁷-Gua (6, 7, 66). W tkankach ludzkich wykryto AF-N⁷-Gua i AF-FAPyr. (67, 68). AF-lizynę oznaczano ilościowo w hydrolizowanych białkach surowicy szczurzej i ludzkiej metodami IAC-LC, IAC-radioimmunologiczną, IAC- ELISA (69-72). Podczas badań moczu (7) i wyciąg z białek surowicy (69, 70) konieczne było dodatkowe oczyszczenie próbek na kolumnie C₁₈ SPE.

Komercyjnie dostępnych kolumn do oznaczania aflatoksyny B₁ można używać też do izolowania jej aduktów (66-72). Ważnym usprawnienie w równoczesnej analizie wielu mikotoksyn była zastosowanie w jednej kolumnie 3 przeciwciał monoklonalnych – rozpoznających aflatoksyny B₁, i M₁ i Q₁ – związanych z Sefarozą 4B aktywowaną bromkiem cyjanu. W takim systemie, suma odzysku metabolitów (w tym także AF-N⁷-Gua, aflatoksyny P₁ i alatoksyno-dihydrodiolu) wzrosła do 90-95%.

Ochratoksyna A

W handlu dostępne są trzy kolumny powinowactwa immunologicznego do oczyszczania ochratoksyny A: Easi-Extract z Rhone-Poulen Diagnostic (Biocode), OchraTest z firmy Vicam i Rida Ochratoxin A z R-Biopharme (Darmstadt, Niemcy). Poza tym, w badaniach żywności różne laboratoria wykorzystują wytwarzane przez siebie kolumny (74-77).

Szczególnie dużo uwagi poświęcono na opracowanie metod oznaczania ochratoksyny A w kawie surowej i palonej oraz produktach zawierających kawę (75-84). Obecna w ekstrakcie kofeina wpływa na działanie kolumny, zatem konieczne jest dodatkowe oczyszczanie przed nałożeniem na kolumnę (79, 81, 82). Aby zwiększyć odzysk ochratoksyny A i zmniejszyć tło w chromatografii najczęściej stosuje się procedury ekstrakcji do fazy stałej na kolumnie fenolowej (Rhone-Poulen metoda niepublikowana 1995a; 79, 81, 81). Do ekstrakcji ochratoksyny A z ziaren kawy surowej lub rozpuszczalnej stosuje się najczęściej mieszaniny metanolu z 1-3% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, 1% wodny roztwór wodorowęglanu sodu i wrzącą wodę. Po rozcieńczeniu buforem PBS lub roztworem Tweenu 20 w PBS podaje się je bezpośrednio na kolumnę (w temperaturze pokojowej) (75, 76, 80, 81, 83, 84).

Zalecana przez Nakijimę i wsp. (76) elucja ochratoksyny A z kolumn OchraTest 50% roztworem DMSO nie jest wydajna. Ilościowo wymywa się ochratoksynę A z kolumny metanolem (84); metanolu używa się też do elucji ochratoksyny A z kolumn Easi-Extract (Rhone-Poulenc, metoda niepublikowana 1995a; 78, 79, 85). W badaniach kawy stosuje się też elucję kwaśnym buforem składającym się z 0,1 M glicyny z kwasem solnym o pH 2,5, zawierającym 30% metanol (75, 80).

Kolumny powinowactwa immunologicznego stosowano też do oznaczania ochratoksyny A w innych rodzajach żywności i płynach ustrojowych (Tabela 1). Piwo można podawać bezpośrednio na kolumnę (83), po odgazowaniu lub wymieszaniu z 2% wodorowęglanem sodu-15% chlorkiem sodu (Rhone-Poulenc, metoda niepublikowana 1995b; 89). Mleko należy przygotować przez trawienie enzymami proteolitycznymi (74) lub oczyścić metodą ekstrakcji ciecz - ciecz (85). Również surowica wymaga ekstrakcji chloroformem (85). Istnieje jedno doniesienie dotyczące wykorzystania kolumn powinowactwa immunologicznego do badań mieszanej żywności (92).

Porównanie wyników badania piwa z wykorzystaniem kolumn powinowactwa i SPE (seria kolumn zawierających fazę C₁₈ i żel krzemionkowy) wykazuje generalnie dobrą zgodność próbek fortyfikowanych i naturalnie zanieczyszczonych. Po oczyszczeniu na kolumnach powinowactwa w chromatogramie było mniej pików (89).

Proces oczyszczania ochratoksyny A na kolumnach powinowactwa został już zautomatyzowany, ale procedura ta nie jest jeszcze tak obszernie zbadana, jak w przypadku aflatoksyn. Systemu ASPEC używano w badaniach zbóż, produktów zbożowych i mięsa (86, 87, 93), natomiast automatycznej stacji roboczej BenchMate w badaniach ekstraktów kawy (81). Kolumny powinowactwa w tym systemie nie są regenerowane do ponownego użytku (86).

Kolumny powinowactwa dla ochratoksyny A mogą nie być całkowicie specyficzne. Na kolumnie zatrzymuje się też ester etylowy ochratoksyny A (ochratoksyna C) (90) , i, nawet po oczyszczeniu kolumny, sok grejpfrutowy zawiera substancje interferujące o takim samym czasie retencji w chromatografii cieczowej (90). Jednym z wielu innych problemów jest to, że używane podłoża mogą być zanieczyszczone ochratoksyną A (85). W latach 1991-1992 niektóre partie podłoża z jednej z firm handlowych zawierały do 0,5 ng ochratoksyny A w kolumnie; obecnie ilości te nie są większe niż 2 pg (85).

Do oznaczania ilościowego ochratoksyny A w żywności, na poziomach poniżej 5 ng/g, zamiast chromatografii cieczowej można stosować pomiar fluorescencji roztworu (dane z informacji producenta Vicam, 1993).

Niedawno kolumny powinowactwa zarówno dla ochratoksyny A jak i dla aflatoksyn, połączone w zestaw, wykorzystano do izolacji tych toksyn z ekstraktów z żywności dla zwierząt domowych (91). Średnie odzyski uzyskane w chromatografii cieczowej, uzyskane w warunkach dostosowanych do jednoczesnego oznaczania wynosiły 84-103% dla aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂, ale tylko 52% dla ochratoksyny A. Natomiast odzyski ochratoksyny A z mielonej pszenicy wynosiły 90-100%. Podejście to warte jest dalszych badań.

Tabela 1. Granice wykrywalności ochratoksyny A w żywności i płynach biologicznych metodą powinowactwa immunologicznego.  

Fumonizyny

Obecnie jest tylko jedna kolumna powinowactwa immunologicznego dostępna w handlu. Ze szczegółowej oceny kolumny Fumonitest (firmy Vicam) przedstawionej w pracy Ware’a i wsp. (94) wynika, że fumonizyny B₁ i B₂ mają jednakowe powinowactwo do przeciwciała, a całkowita pojemność kolumny wynosi 1,2 m g fumonizyny. W innych badaniach (95) określono pojemność wiązania kolumny na 2,5 m g fumonizyny B₁. W badaniach kukurydzy i produktów z kukurydzy metodą, która obejmowała oczyszczanie na kolumnach Fumonitest i oznaczanie metodą chromatografii cieczowej, dla 50 ng fumonizyny uzyskano dobre odzyski fumonizyn B₁ i B₂ (75-90%) (94-97). Mleko może być podawane bezpośrednio na kolumnę (98). Produkt hydrolizy fumonizyny B₁, aminopentol AP₁, nie jest rozpoznawany przez przeciwciało i zatrzymywany na kolumnie; podczas badania mleka przechowywanego w 4° C w chromatogramie pojawia się zakłócający pik, łatwo mylony z AP₁ (98). Na kolumnę Fumonitest można też podawać bezpośrednio piwo. Odzyski fumonizyn wahają się pomiędzy 47 a 114% (99). W Tabeli 2 przedstawiono jakie są granice wykrywalności dla fumonizyn oznaczanych metodą chromatografii cieczowej w różnych matrycach, po oczyszczaniu na kolumnie powinowactwa. Porównano oczyszczanie na kolumnie jonowymiennej SPE - SAX w badaniach puszkowanej i mrożonej kukurydzy oraz pogorzelnianym ziarnie suszonym (5). Odzyski fumonizyny B1 wynosiły przeciętnie >80% dla kolumn powinowactwa i <40% (0% dla pogorzelnianego ziarna suszonego) dla kolumn SAX.

Do szybkich testów przesiewowych w kierunku obecności fumonizyn w kukurydzy, na poziomie poniżej 1 m g/g, stosuje się oczyszczanie na kolumnach powinowactwa, i fluorymetryczne oznaczanie sumy zawartości fumonizyn po powstaniu pochodnych, uzyskanych przez działanie o-ftalodialdehydo-2-merkaptoetanolu.

Zearalenon

Dostępne są w handlu dwie kolumny: ZearalaTest (firmy Vicam) i Easi-Extract. Przy pomocy ZearalaTestu wykrywa się zearalenon metodą fluorymetrii w środkach spożywczych w tak niskich stężeniach jak 0,2 ng/g (Vicam, opis metody 1993). Kolumny Easi-Extract pozwalają na detekcję w zbożach metodą chromatografii cieczowej <5 ng/g zearalenonu. Ponieważ na kolumnach Easi-Extract dochodzi do reakcji krzyżowej z podobnym strukturalnie zearanolem, można ich używać do badania mięsa pod kątem czynnika wywołującego wzrost anaboliczny (Biocode Technical Notes, 1993).

Kolumna Easi-Extract oceniono do oznaczania metodą chromatografii cieczowej stężenia zearalenonu w kukurydzy w zakresie 10-200 ng/g. Granica wykrywalności wynosił 4 ng/g, całkowity odzysk metody wynosił 94% i dobrze wypadło porównanie metody z standardowo stosowaną metodą ekstrakcji ciecz-ciecz (101).

Tabela 2. Granice wykrywalności fumonizyn oznaczanych metodą chromatografii cieczowej w żywności
 

Azcona i wsp. (102) do badania zawartość zearalenonu w mleku metodą ELISA zastosowali kolumny powinowactwa przygotowane przez połączenie specyficznego przeciwciała monoklonalnego z Sefarozą 4B, aktywowaną bromkiem cyjanu. Granice wykrywalności dla odtwarzanego mleka odtłuszczonego wynosiły 0,5-0,1 ng/ml, w zależności od tego czy 5 czy 10 ml mleka nałożono kolumnę. Odzyski metody wynosiły 110-113% w zakresie 5-50 ng/ml.

Deoksyniwalenol

Deoksyniwalenol izolowany ze zbóż można oczyścić na kolumnach DONtest (Vicam) i następnie oznaczać po otrzymaniu pochodnych metodą fluorymetrii. Czułość metody jest poniżej 0,5 m g/g (Vicam, informacja producenta 1995). Oznaczenie metodą chromatografii cieczowej wykazało, że odzyski deoksyniwalenolu z kolumny są bardzo małe, większość zostaje wymyta przez wodę (G.A. Lombaert, informacja ustna, 1996). Szybki układ testujący - test DON/fluorymetr - wymaga kompensacji. Nasze wstępne wyniki z procedura fluorymetryczną są o 30-120% wyższe niż uzyskane w ostatnio uwiarygodnionych badaniach z zastosowaniem chromatografii cieczowej (103).

Regeneracja kolumn

Pierwsze doniesienie o regeneracji kolumn pochodzi z pracy Groopmana, który regenerował je przemywając buforem PBS (pH 7,4). Następnie badano możliwości ponownego użycia kolumn do izolacji innych mikotoksyn (Tabela 3).

Możliwość ponownego użycia kolumn ma szczególne znaczenie zwłaszcza w systemie automatycznym (43, 63-65). Zwykle przemywanie kolumny po użyciu wodą lub buforem PBS regeneruje ją; szczegółowe warunki mogą zależeć od tego czy przeciwciało jest mono- czy poliklonalne. Farjam i wsp. (63) stwierdzili, że w przypadku kolumn do izolacji aflatoksyny G₂ regeneracja przeciwciała monoklonalnego wymaga co najmniej 20-minutowego kontaktu z wodą, natomiast regeneracja przeciwciała poliklonalnego nie wykazuje zależności od czasu. Zauważono zmniejszanie się odzysków aflatoksyn M₁ i B₂ w czasie kilku pierwszych pasaży przez kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne, ale nie poliklonalne (64). Dializa powoduje usunięcie składników, które mają wpływ na regenerację i wydłużenie czasu trwania kolumn powinowactwa używanych do oczyszczania mleka zawierającego aflatoksynę M₁ (65).Po oznaczeniu ochratoksyny A w surowicy ludzkiej, w winie i soku winogronowym, aby umożliwić renaturację przeciwciała, zużytą kolumnę napełnioną buforem PBS (zawierającym azydek sodu) należy przechowywać przez co najmniej 20 godzin w lodówce (90). W bardziej szczegółowych badaniach, prowadzonych z wykorzystaniem wzorca ochratoksyny A, wykazano, że przed ponownym użyciem konieczna jest 48h regeneracja w lodówce.

Wnioski

Użycie kolumn powinowactwa, zawierających przeciwciała, stało się ważną techniką oczyszczenia mikotoksyn podczas analizy, zwłaszcza kiedy w handlu pojawiły się kolumny dla aflatoksyn, ochratoksyny A, fumonizyn, zearalenonu i deoksywalenolu. Ich główną zaletą jest specyficzność, dzięki której można wyeliminować większość zanieczyszczeń zewnętrznych występujących w ekstrakcie i uzyskać dzięki temu uzyskać niskie granice wykrywalności, szybkość, małe zużycie rozpuszczalników, możliwość automatyzacji i możliwość wielokrotnego używania kolumn. Głównymi wadami są koszta kolumny, fakt, że nie ma w handlu kolumn dla wszystkich mikotoksyn i sporadyczna konieczność stosowania wstępnego oczyszczenia. W niektórych kolumnach, niedostateczne odzyski są następstwem niskiego powinowactwa toksyny i niewystarczającej ilości przeciwciała związanego na kolumnie (np. dla aflatoksyn G₂ i M₁ oraz deoksyniwalenolu). Czasami substancje interferujące mogą być związane na kolumnie i ulegają desorpcji, np. fałszywe wyniki pozytywne wyniki badań na obecność ochratoksyny A w soku grejpfrutowym. Zwykle do oznaczenia końcowego stosuje się metodę chromatografii cieczowej, ale wykalibrowany fluorymetr i – o ile jest to konieczne odczynniki do uzyskiwania fluoryzujących pochodnych - pozwalają na szybsze oznaczenie. Do kolumn powinowactwa immunologicznego potrzebne jest więcej przeciwciał niż do innych metod immunologicznych. Stąd też koszty pojedynczego oznaczenia są duże. Metody regeneracji kolumn rozwijane są od ponad 10 lat. Aby zmniejszyć koszta, konieczne są dalsze badania dotyczące wielokrotnego użycia, automatyzacji i techniki klonowania przeciwciał metodami technologii rekombinacyjnych, dzięki którym możliwe byłoby szybkie i efektywne przeszukanie (screening) dużej liczby klonów w celu wybrania jednego, kodującego specyficzne przeciwciało, jako wektora do transfekcji; w ten sposób zapewnione będą jednakowe dostawy dużych ilości przeciwciała potrzebnego do przygotowania kolumn powinowactwa. Lee i wsp (106) donieśli o postępie w produkcji rekombinowanych przeciwciał rozpoznających diacetoksyscirpenolu i aflatoksyny M₁. Do tej pory nie udało się wyizolować z biblioteki w np. Escherichia coli stabilnej domeny przeciwciała, wiążącej z wysokim powinowactwem mikotoksyny. Wiele przeciwciał zawartych w jednej lub różnych kolumnach powinowactwa wymaga dalszych badań i prób zastosowania w
 
 

jednoczesnym oznaczaniu wielu mikotoksyn w tym samym ekstrakcie.
 
 

Tabela 3. Wielokrotne wykorzystanie kolumn powinowactwa immunologicznego w badaniach mikotoksyn.